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编者按

5年前，不懂基因编辑的神经生物学周海波博士偶然遇到熟悉基因编辑但是不懂神经生物学的杨辉研究员，这期间他们之间能碰撞出什么绚烂的火花？如果说，2018年他们合作发表在Nature Neuroscience上的工作（在脑内实现多个基因的同时激活并且能够将脑内的星形胶质细胞转化为神经元）只是牛刀小试，那么今日在Cell上在线发表的这项工作可谓是一场华丽的升级，这项成果运用最新CasRx系统特异性地在视网膜穆勒胶质细胞中敲低Ptbp1基因的表达，首次在成体中实现了视神经节细胞的再生，并且恢复了永久性视力损伤模型小鼠的视力。同时，该研究还证明了这项技术可以非常高效且特异地将纹状体内的星形胶质细胞转分化成多巴胺神经元，并且基本消除了帕金森疾病的症状。该工作称得上是神经生物学领域一项重大突破，给今后临床上治疗相关疾病奠定了坚实的基础。

责编 | 迦溆

点评丨薛愿超（中科院生物物理所研究员）

更多精彩详见文末点评和编后记！

人类的神经系统包含成百上千种不同类型的神经元细胞。在成熟的神经系统中，神经元一般不会再生，一旦死亡，就是永久性的。神经元的死亡会导致不同的神经退行性疾病，常见的有阿尔兹海默症（Alzheimer disease，AD）和帕金森症（Parkinson's disease，PD）。此类疾病的病因尚不明确且没有根治的方法，因此对人类的健康造成巨大威胁。据统计，目前全球大约有1亿多的人患有神经退行性疾病，而且随着老龄化的加剧，神经退行性疾病患者数量也将逐渐增多。在常见的神经性疾病中，视神经节细胞死亡导致的永久性失明和多巴胺神经元死亡导致的帕金森疾病是尤为特殊的两类，它们都是由于特殊类型的神经元死亡导致。

我们之所以能看到外界绚烂多彩的世界，是因为我们的眼睛和大脑中存在一套完整的视觉通路，而连接眼睛和大脑的神经元就是视神经节细胞。作为眼睛和大脑的唯一一座桥梁，视神经节细胞对外界的不良刺激非常敏感。研究发现很多眼疾都可以导致视神经节细胞的死亡，急性的如缺血性视网膜病，慢性的如青光眼。视神经节细胞一旦死亡就会导致永久性失明。据统计，仅青光眼致盲的人数在全球就超过一千万人。帕金森疾病是一种常见的老年神经退行性疾病。它的发生是由于脑内黑质区域中一种叫做多巴胺神经元的死亡，从而导致黑质多巴胺神经元不能通过黑质-纹状体通路将多巴胺运输到大脑的另一个区域纹状体。目前，全球有将近一千万人患有此病，我国尤为严重，占了大约一半的病人。如何在成体中再生出以上两种特异类型的神经元，一直是全世界众多科学家努力的方向。

CRISPR/Cas9介导基因编辑技术自从问世以来，已经在各个研究领域得到了非常广泛的应用。由于CRSIPR/Cas9是直接对DNA进行永久性修改并且具有潜在的脱靶效应，在临床应用中，可能会产生巨大的安全隐患。最近几年，以Cas13家族为代表的RNA靶向基因编辑技术被发展出来，其中以CasRx（RfxCas13d）尤为受到关注与重视【1】。在不触动DNA的前提下，这项技术就可以对目标基因的表达实现非常强的抑制效果，值得一提的是2020年3月18日，上海科技大学黄鹏羽实验室与中科院神经科学研究所杨辉实验室合作，在Protein & Cell杂志发表研究论文，首次利用Cas13d家族蛋白CasRx在小鼠肝脏中实现了基因的高效沉默，从而证实Cas13d系统在成体动物体内也具有靶向沉默RNA的活性【2】。相对于Cas9，Cas13家族蛋白比较小，很容易被包装进AAV中，而且非常特异，在RNA水平上极少产生脱靶效应，让其在安全性以及潜在的疾病治疗上拥有了巨大的优势。

2020年4月8日，来自中国科学院脑智卓越中心（中国科学院神经科学研究所）的杨辉团队在Cell上发表了题为Glia-to-Neuron Conversion by CRISPR-CasRx Alleviates Symptoms of Neurological Disease in Mice的文章。本项研究在杨辉研究员和博士后周海波的共同指导下完成。该项研究通过运用最新开发的RNA靶向CRISPR系统CasRx特异性地在视网膜穆勒胶质细胞中敲低Ptbp1基因的表达，首次在成体中实现了视神经节细胞的再生，并且恢复了永久性视力损伤模型小鼠的视力。同时，该研究还证明了这项技术可以非常高效且特异地将纹状体内的星形胶质细胞转分化成多巴胺神经元，并且基本消除了帕金森疾病的症状。该研究将为未来根治以上两种严重的神经退行性疾病提供了可能，同时也为众多神经退行性疾病的治疗提供一个新的途径。

该研究中，研究人员首先在体外细胞系中筛选了高效抑制Ptbp1（BioArt注：2013年UCSD的付向东教授实验室在Cell报道了单独敲低Ptbp1可以在体外实现将小鼠成纤维细胞转分化为功能性神经元，第一作者薛愿超博士现为中科院生物物理所研究员【3】）表达的gRNA，设计了特异性标记穆勒胶质细胞和在穆勒胶质细胞中表达CasRx的系统。所有元件以双质粒系统的形式被包装在AAV中并且通过视网膜下注射，特异性地在成年小鼠的穆勒胶质细胞中下调Ptbp1基因的表达。大约一个月后，研究人员在视网膜视神经节细胞层发现了由穆勒胶质细胞转分化而来的视神经节细胞，并且转分化而来的视神经节细胞可以像正常的细胞那样对光刺激产生相应的电信号。研究人员进一步发现，转分化而来的视神经节细胞可以通过视神经和大脑中正确的脑区建立功能性的联系，并且将视觉信号传输到大脑。

在视神经节细胞损伤的小鼠模型中，研究人员发现转分化的视神经细胞可以让永久性视力损伤的小鼠重新建立对光的敏感性。为进一步发掘Ptbp1介导的胶质细胞向神经元转分化的治疗潜能，研究人员证明了该策略还能特异性地将纹状体中的星形胶质细胞非常高效的转分化为多巴胺神经元，并且证明了转分化而来的多巴胺神经元能够展现出和黑质中多巴胺神经元相似的特性。在行为学测试中，研究人员发现这些转分化而来的多巴胺神经元可以弥补黑质中缺失的多巴胺神经元的功能，从而将帕金森模型小鼠的运动障碍逆转到接近正常小鼠的水平。

图注：（上）CasRx通过靶向的降解Ptbp1 mRNA从而实现Ptbp1基因表达的下调。（中）视网膜下注射AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1可以特异性的将视网膜穆勒胶质细胞转分化为视神经节细胞，转分化而来视神经节细胞可以和正确的脑区建立功能性的联系，并且提高永久性视力损伤模型小鼠的视力。（下）在纹状体中注射AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1可以特异性的将星形胶质细胞转分化为多巴胺神经元，从而基本消除了帕金森疾病模型小鼠的运动症状。

据了解，该工作在投稿Cell杂志期间得到了审稿人的高度评价，审稿人认为"如何利用RNA靶向CRISPR系统来达到治疗的目的，这项研究给出了一个优雅和令人振奋的例子（This manuscript presents an elegant and exciting example of using RNA-targeting CRISPR systems for therapeutic purposes）"，"以往的研究都集中在利用RNA靶向CRISPR系统来直接降低遗传病模型中有害的突变转录本，而这项研究却利用这些工具在体内进行治疗性的细胞命运转分化，从而展现一个全新的视角，这是非常有意思的，而且可以得到广泛的应用（previous efforts of RNA-targeting CRISPR systems focused on knockdown of toxic mutant transcripts in models of mendelian inherited genetic disease, whereas this study presents the novel aspect of using these tools for in vivo therapeutic cell fate conversion, which is quite interesting and could be a broadly applicable approach）"。

需要指出的是，虽然科学家们在实验室里取得了重要进展，但是要将研究成果真正应用于人类疾病的治疗，还有很多工作要做，未来还需要进一步在非人灵长类动物身上进行进一步研究。人类的视神经节细胞能否再生？帕金森患者是否能通过该方法被治愈？这些问题有待全世界的科研工作者共同努力去寻找答案。

总的来说，这是一项极其有价值而且重要的工作，为未来众多神经退行性急性的治疗提供了非常有前景的治疗方案。

脑智卓越中心博士后周海波、助理研究员苏锦霖、博士研究生胡新德、周昌阳、李贺、陈昭融为论文共同第一作者。中科院脑智卓越中心杨辉研究员和周海波博士为本文的共同通讯作者。同时，研究团队特别的感谢脑智卓越中心学术主任蒲慕明院士以及智卓越中心徐华泰研究员、张翼凤研究员、姚海珊研究员和周嘉伟研究员对该项研究的大力协助。

团队主要作者：从左到右依次为苏锦霖，杨辉，周海波；右上：胡新德，右下：周昌阳。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.03.024

参考文献

1、Konermann, S., Lotfy, P., Brideau, N. J., Oki, J., Shokhirev, M. N., & Hsu, P. D. (2018). Transcriptome engineering with RNA-targeting type VI-D CRISPR effectors.Cell, 173(3), 665-676.

2、He, B., Peng, W., Huang, J., Zhang, H., Zhou, Y., Yang, X., ... Yang, H. & Peng, H. (2020). Modulation of metabolic functions through Cas13d-mediated gene knockdown in liver.Protein & Cell, 1-7.

3、Xue, Y., Ouyang, K., Huang, J., Zhou, Y., Ouyang, H., Li, H., ... & Fu, X. (2013). Direct conversion of fibroblasts to neurons by reprogramming PTB-regulated microRNA circuits.Cell, 152(1-2), 82-96.

专家点评

薛愿超（中科院生物物理研究所研究员）

神经元结构或功能的丧失是神经退行性疾病发生的根本原因。在体内，尤其是原位再生神经元并重建神经环路，将有望治疗由于神经细胞损伤所导致的退行性病变，如帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病和神经性失明等。

我在UCSD付向东教授实验室进行博士后研究工作时，意外地发现敲低RNA结合蛋白PTBP1可在体外将小鼠成纤维细胞直接转分化为功能性神经元（Cell, 2013）。该工作发表后，我们收到了大量邮件，咨询能否将该方法应用于神经退行性疾病的临床治疗？我清晰地记得，有位瑞典老太太从报纸上看到新闻后写信给付老师，希望能够在她罹患帕金森综合征的丈夫身上进行治疗尝试。因为我当时打算回国工作，没有延续在付老师实验室进行PTBP1敲降治疗帕金森综合征的研究，但这件事给了我巨大的震撼，也使我第一次意识到了基础研究的价值和重要性！正如日本科学家本庶佑所讲"希望国家能以长远的眼光重视基础研究，基础研究本来就是一种浪费，但从这浪费之中会生出伟大的东西…"。同样，受到众多患者咨询的触动，付老师从2013年开始即投入了大量的精力、实验室人力和物力，着手在动物模型上攻关PTBP1敲降治疗帕金森综合征的方法，经过不懈努力终于在2017年下半年在动物模型上成功实现了对帕金森综合征的治疗。据悉，相关研究论文从2017年12已经开始投稿，日前刚刚在预印本杂志BioRxiv上在线发布（https://doi.org/10.1101/2020.04.06.028084）。

突破性的科学研究总是令人神往、欲罢不能。中国本土的科研生力军突飞猛进。喜见Cell期刊今日发表来自中科院神经研究所杨辉课题组的研究工作，利用CRISPR-CasRx RNA编辑系统在小鼠体内敲降PTBP1后，实现了将视网膜上的Muller神经胶质细胞直接转分化为视网膜神经节细胞（Retinal Ganglion Cells，RGC），并缓解由于RGC缺失导致的视力损失；同时，他们利用相同的策略也在帕金森小鼠模型上实现了纹状体原位多巴胺神经元再生，并缓解小鼠运动功能失常，证明了PTBP1敲降介导的神经细胞重编程技术在再生医学上的应用，并为我们展现了CRISPR-CasRx RNA编辑系统在神经相关退行性病变应用中的潜力。

与细胞移植治疗相比，原位再生神经元有几大优点：1. 原位再生的神经元可直接整合进周围的神经网络并建立环路，避免了外源细胞移植遇到的定点存活和整合问题；2. 胶质细胞量大并且可以增殖，将一部分胶质细胞转分化为神经元是实现神经修复的极好选择；3.敲降PTBP1往往会抑制细胞增殖，并促进分化，这避免了干细胞移植导致的潜在大量增殖和致癌性。当然，任何技术都有其局限性，我认为做好以下两点将能够显著缩短临床应用的窗口期：1. Cas13家族蛋白一旦被激活后往往存在附带的RNA切割活性，未来需要更细致的调查CasRx酶（RfxCas13d-NLS）及PTBP1-sgRNA复合物在细胞内的结合位点，以评估AAV感染细胞不同时间点后的脱靶效应程度，这对于后期临床应用的安全性会很重要；2.考虑到人和鼠神经系统的区别，相同的策略在灵长类动物体内能否实现原位转分化值得测试和期待。总之，来自杨辉课题组和付向东老师课题组的研究工作是基础研究和临床应用的典范，也再一次强调了基础研究的重要性！

编后记

本文的第一兼共同通讯作者周海波博士在荷兰Erasmus University Rotterdam获得神经科学硕士和博士学位，师从著名运动神经学家，荷兰皇家科学院院士Chris de Zeeuw教授。一次偶然的机会认识了刚刚从MIT回国组建基因编辑实验室的杨辉研究员。双方在一次简短的交流后，意识到基因编辑技术可能会在神经性疾病治疗领域大放异彩。随即周海波在博士毕业后于2015年初回国作为博士后加入杨辉研究组，神经退行性疾病的治疗作为世界性难题自然成了双方共同攻克的方向。其他类型细胞向神经元的转分化一般都是通过过表达单个或者多个转录因子实现的，但是对于一些特殊类型神经元如多巴胺神经元的转分化往往需要同时表达多个转录因子，这在体内是非常难实现的。为了攻克上述问题，他们自2015年开始研制，开发了一套高效的CRISPR激活系统SPH，这项技术可以在脑内实现多个基因的同时激活并且能够将脑内的星形胶质细胞转化为神经元，这项工作并于2018年1月份发表在Nature Neuroscience上。但是由于SPH载体过大，很难通过AAV导入成体并且实现神经退行性疾病的治疗。

2013年，来自加州大学圣地亚哥分校付向东教授实验室发表在Cell上的工作证明只需要简单的敲低单个基因Ptbp1就可以在体外实现不同种类细胞向神经元的转分化，展现了非常大的治疗潜力。同时这也是唯一有文献报道的一个通过敲低基因表达就能实现神经元高效转分化的靶点。所以除了基因激活，杨辉与周海波也一直在摸索能否通过基因编辑技术降低基因表达在体内实现神经元的转分化。最后他们决定采用RNA靶向基因编辑工具Cas13家族中最新的一个蛋白CasRx来实现对Ptbp1的抑制，CasRx不仅最小，而且相对于Cas13家族其他蛋白以及之前报道的所有抑制基因表达的技术能实现更高效更特异的抑制效果。在研究过程中，遇到了非常多的阻碍，尤其是研究者一直无法标记诱导的视神经节细胞轴突及其在脑内的延伸，经过大量的尝试终于通过巧妙的运用Ai9小鼠解决问题，从而证明了诱导的视神经节细胞能投射到脑内正确的区域。本项研究于2018年开始投稿，期间经历过许多曲折，经过多轮的改进，最终投稿Cell在今年3月被接受发表。值得一提的是，周海波博士最近两年发表了一系列相关的重要成果。除了上述的Cell和Nature Neuroscience外，其本人还是去年杨辉组Nature和最近National Science Review的共同通讯作者。

杨辉团队的主要作者，从左依次为胡新德、苏锦霖、杨辉、周海波

该论文的通讯作者杨辉研究员在美国麻省理工Whitehead研究所Rudolf Jaenisch课题组做博士后，主要研究方向为基因编辑与干细胞，2014年回国担任中国科学院神经科学研究所灵长类疾病模型研究组组长，主要主要围绕新型基因编辑技术的脱靶安全性问题以及在动物模型的建立和疾病治疗中的应用,获得了一系列原创性成果,在Nature、Science、Nature Neuroscience、Developmental Cell、Cell Research、Protein & Cell等期刊发表通讯/共同通讯作者文章十余篇，先后获得"中源协和生命医学创新突破奖"、"何梁何利科技进步奖"等，相关成果入选2019年度中国生命科学十大进展，2019年获得国家杰出青年科学基金资助。

据杨辉研究员透露，这篇Cell文章是他建组以来最满意、最有成就感也最感动的一个工作，解决了转分化领域的两个大病，治疗效果都是目前报道最好的，幻想着有一天这个疗法攻克各种退行性疾病。他同时指出这才是第一步，能够最终成药让病人受益才是最重要的。此项工作能够顺利完成，也说明中国科研整体环境已经有这个实力、也有这个氛围源源不断产出新的、好的东西。比较有意思的是，杨辉加入神经所之前不懂神经，周海波加入杨辉课题组之前不懂基因编辑。据周海波私下透露，他加入杨辉组本来只打算待几个月的，谁知道一待就是五年，期间做出了多项重要成果。

杨辉团队的主要成员和蒲慕明院士（前排中），后排从左依次为苏锦霖、周昌阳、胡新德，前排左起为周海波、蒲慕明、杨辉

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